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【金沙澳门娱乐网址】胎盘间充质干细胞治疗缺

2020-04-15 07:03

胎盘间充质干细胞治疗缺血性疾病又有新发现

由于基因工程技术的迅速发展,许多细胞因子的cDNA克隆获得成功,并获得了高活性基因表达产物,这给细胞因子的细胞生物学和分子生物学的研究提供了必要的前提。目前已有IL-2、EPO、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ和IFN-α等细胞因子投放市场,有更多的细胞因子正在进行不同期的临床验证。细胞因子在正式投入市场成为商品前,必须经过临床前筛选实验、临床Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期试用等几个阶段的验证。

近日,国家干细胞工程技术研究中心主任韩忠朝团队发表在Stem Cell Research Therapy上的一篇题为《VCAM-1+胎盘绒毛膜间充质干细胞显示出强有力促血管生成活性》的文章受到国内外相关领域的高度关注。该文章阐述了血管细胞黏附分子-1+胎盘绒毛膜间充质干细胞具有良好的促血管生成活性,成为理论走向临床治疗的重要一步。

一、白细胞介素

许多研究已经证明,来自不同组织源的间充质干细胞对缺血性疾病有不同程度的治疗效果,有研究人员认为是由于间充质干细胞的旁分泌作用,然而机制尚不明确。

在1979年第二届国际淋巴因子专题讨论会上,将来自单核-巨噬细胞、T淋巴细胞所分泌的某些非特异性发挥免疫调节和在炎症反应中起作用的因子称为白细胞介素。目前已知许多IL是来自单核-巨噬细胞和淋巴细胞以外的其它细胞。已正式命名的白细胞介素有IL-1~IL-15。

该研究分离了胎盘绒毛膜来源的VCAM-1+间充质干细胞亚群,在血管生成的不同阶段以及不同水平上研究了VCAM-1+间充质干细胞和VCAM-1-间充质干细胞的性质,评估了其促血管生成能力,探讨了其在缺血性疾病上的应用价值。

IL-1

该研究显示,8个血管生成基因高表达于VCAM-1+胎盘绒毛膜间充质干细胞;同样,血管生成细胞因子特别是HGF、IL8、angiogenin、angiopoitin-2、PAR、

IL-1是一种单核因子。1972年Gery等发现人白细胞培养的上清中含有一种可溶性物质,这种物质可促进小鼠胸腺细胞对植物血凝素的有丝分裂反应。起初命名为淋巴细胞激活因子单核细胞、巨噬细胞小鼠巨噬细胞细胞系P388D1、J774、PU5-1.8、WEHI-3以及人前单核细胞株U937等在脂多糖刺激后都能分泌大量的IL-1。

CXCL1、IL-1、IL-1、CSF2、CSF3、MCP-3、

表皮细胞、NK细胞、B细胞、成纤维细胞、内皮细胞、脑胶质星状细胞、肾小球系膜细胞、滑膜衬里细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、胎盘细胞、白血病细胞、PMN等在某些条件下亦可产生IL-1。

CTACK和OPG在VCAM-1+胎盘绒毛膜间充质干细胞中显著增加。将VCAM-1+胎盘绒毛膜间充质干细胞输注到BALB/c裸鼠的缺血后肢,其下肢功能显著改善,证明了VCAM-1+胎盘绒毛膜间充质干细胞具有良好的旁分泌促血管生成效果,可作为相关疾病的重要治疗手段。

许多因素可以直接影响单核-巨噬细胞IL-1的分泌:①细胞因子如巨噬细胞激活因子、集落刺激因子、IFN-α、IFN-γ对IL-1产生具有增强作用。②LPS、PPD、BCG和李斯特菌,葡萄球菌、链球菌外毒素,活病毒等也是IL-1产生的刺激剂。在外周血中20pg/ml内毒素刺激单核细胞即可产生IL-1,因此在一般培养条件下,由于微量内毒素的污染可刺激单核细胞分泌IL-1。10ng/mlLPS可使单核细胞合成IL-1增加100倍。③蛋白激酶C的激活剂乙酸肉豆蔻佛波醇和IL-1β分别由159和153个氨基酸残基组成,分子量约17.5kDa,同源性为28%。IL-1对糜蛋白酶敏感。不同细胞所产生IL-1的等电点可有所差异。

VCAM-1又被称为CD106,属于免疫球蛋白超家族,是重要的黏附分子,被认为在动脉粥样硬化和类风湿性关节炎的发病过程中具有重要的作用。VCAM-1在早期胚胎发育中也起着至关重要的作用,胚胎早期缺乏VCAM-1会导致胎盘严重缺陷。

3.IL-1的受体 T细胞、成纤维细胞表面IL-1受体为80kDa,而B细胞则为68kDa。编码这两种IL-1受体是不同基因产物。P80IL-1R称为IL-1RtIIg超家族分子量残基磷酸化 配体受体结合后变化易内化易降解

韩忠朝团队长期关注胎盘绒毛膜来源的VCAM-1+间充质干细胞。此前,该团队就已经通过大量实验认识到VCAM-1+CV-MSC分泌前列腺素E2的能力很强,能强烈抑制植物血凝素刺激的人外周血单个核和脐血CD4+T细胞的IFN-和TNF-的分泌,并能有效地降低CD4+T细胞内IFN-、TNF-、T-bet、IL-21和IL-22的表达。基因芯片结果也显示VCAM-1+CV-MSC表达更多的免疫相关基因,证实了VCAM-1+CV-MSC是一个具有很强免疫调节功能的亚群。

IL-1RtⅠ:IL-1RtⅠ cDNA克隆在人和鼠均已获得成功。IL-1RtⅠ为穿膜蛋白,胞膜外区有3个结构域属免疫球蛋白超家族,穿膜区有20个氨基酸残基,胞浆区含有丝氨酸和苏氨酸残基,当IL-1与IL-1RtⅠ结合后丝氨酸和苏氨酸很快被磷酸化。通过基因转染Hela细胞实验证明,IL-1RtⅠN端2个结构域与配体结合有关。针对N端17个氨基酸片段的McAb能阻断IL-1RtⅠ与IL-1结合。IL-1与IL-RtⅠ结合后即发生内化IL-1RtⅡ:主要分布于EBV转化的B细胞、Raji细胞、巨噬细胞、胎盘、Th2克隆、活化T细胞、PMN和骨髓细胞等。胞膜外区有3个结构域属免疫球蛋白超家族,与IL-1RtⅠ之间有28%氨基酸同源性,穿膜区有更高的同源性,但胞浆区要比Ⅰ型受体短,可能在介导信号传递上有差别。IL-1与IL-1RtⅡ结合后易发生降解而不象IL-1RtⅠ那样发生内化。IL-1RtⅡ经蛋白水解酶水解后可形成可溶性的IL-1结合蛋白IL-1ra的产生:IL-1ra体外可由LPS刺激的单核细胞,PMA、PHA、CSF刺激的单核细胞系产生。

目前已有大量国内外研究表明VCAM-1可能参与血管生成。一般情况下,VCAM-1在静息的内皮细胞低表达或不表达,但可以被各种炎症因子诱导表达,如VCAM-1可在活化的血管内皮细胞中表达;CV-MSC可以组成性地表达VCAM-1,除了膜结合的形式,还有可溶性的VCAM-1存在。

IL-1ra分子的结构和基因:IL-ra基因克隆1990年获得成功,编码人IL-1α、IL-1β和IL-1ra基因都定位于2号染色体。IL-1racDNA编码的多肽为17kDa,糖基化后分子量为25kDa,但糖基对IL-1ra活性并非必需。未成熟的IL-1ra分子为177个氨基酸残基的肽链,N端25个氨基酸多为疏水性氨基酸,构成典型的信号肽顺序。成熟分子由152个氨基酸残基组成。在65、68、116及122位上有4个保守的半胱氨酸残基,Cys65-116,Cys68-122间形成链内二硫键。从cDNA推算的氨基酸序列IL-1ra与IL-1α和IL-1β分别有19%和26%的同源性,人和小鼠的IL-1ra有77%同源性。

因此,VCAM-1可以作为表面标记物来进行间充质干细胞优越亚群的筛选,为将来间充质干细胞在临床上应用于治疗心肌梗死、中风等缺血性疾病提供了新的策略,也为将来临床治疗上提供了一种高效的间充质干细胞亚群。

IL-1ra的生物学作用:IL-1ra能特异性地抑制T细胞表面IL-1R与IL-1结合,但不抑制TNF或IL-2与相应受体的结合。IL-1ra不与IL-1直接结合,而是一种IL-1与IL-1R相互结合的竞争性抑制物。rIL-1ra与Ⅰ型和Ⅱ型IL-1R都能结合,但与IL-1RtⅠ结合的亲和力要高于与IL-1RtⅡ结合的亲和力。rIL-1ra、rIL-1α、rIL-1β与IL-1RtⅠ结合的亲和力比较相近,但rIL-1ra、rIL-1α与IL-1RtⅡ结合的亲和力要低于rIL-1β与IL-1RtⅡ结合的亲和力。IL-1ra能抑制IL-1刺激滑膜细胞PGE2的产生和软骨细胞胶原酶合成,抑制胸腺细胞的增殖以及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞与内皮细胞的粘附。在体内可抑制IL-1引起的发热。IL-1ra可结合T细胞和成纤维细胞表面IL-1RtⅠ,也能抑制IL-1与PMN、B细胞、髓样单核细胞白血病细胞IL-1RtⅡ的结合。IL-1ra可抑制PBMC、骨髓细胞衍生的髓样淋巴细胞白血病细胞自发增殖和自发产生IL-1、IL-6和GM-CSF。在体内,IL-1ra可阻止LPS引起的家兔死亡,减轻免疫复合物所诱导的炎症,抑制小鼠骨髓移植后GVHR的发生,提高存活率,此外,还可防治动物实验性溃疡性结肠炎。

我国正逐步进入老龄化社会,严重肢体缺血的外周动脉疾病呈多发病率趋势,死亡率也逐年上升。目前的主要手术治疗手段效果并不理想。因此,间充质干细胞的这种促血管生成特性受到临床上的高度关注。

IL-1ra与临床:正常人血清IL-1ra水平在200pg/ml以下,感染、炎症以及内毒素血症病人血清中IL-1ra水平可升高到8ng/ml。应用IL-1ra治疗败血症已进入Ⅲ期临床验证,死亡率明显下降。此外IL-1ra治疗类风湿性关节炎也已开始在临床验证。IL-1ra在体内的副作用很小,但应用剂量较大,阻断IL-1 50%生物学效应时所用IL-1ra的用量是IL-1用量的10~500倍。

干细胞生物技术是当今生命科学领域前沿技术,在疾病预防、治疗和抗衰老、美容等方面有着广泛的应用前景。在我国,干细胞技术先后被列入863973等重大科研专项。其中,胎盘来源的间充质干细胞具有免疫原性低、活力较强、无伦理问题等优点,成为近几年研究的焦点。

5.IL-1的生物学作用 IL-1具有广泛的免疫调节作用,并有致热和介导炎症的作用,它的生物学功能是通过与相应高亲和力受体结合而介导的,IL-1生理条件下的浓度仅在10-12~10-14M之间。IL-1作用无明显的种属特异性,人IL-1可作用于小鼠源性的细胞。主要表达IL-1RtⅡ的细胞似乎比表达IL-1RtⅠ细胞相对有种属特异性。

促进胸腺细胞、T细胞的活化、增殖和分化:T细胞经抗原、有丝分裂原或抗TCR/CD3刺激后表达IL-1受体,在IL-1作用下T细胞被活化,由G0期进入G1期。活化后的T细胞分泌IL-2、IFN-γ、GM-CSF、IL-4等细胞因子,并表达IL-2受体进而T发生增殖和分化。IL-1还可增加T细胞表面MHCⅡ类抗原的表达。IL-1能诱导杀伤性T淋巴细胞的分化,在混合淋巴细胞培养中,IL-1诱导CTL的产生可能是通过促进T细胞分泌IL-2和IFN-γ。IL-6可协同IL-1活化T细胞和刺激IL-2的产生。

促进B细胞功能:协同IL-4等细胞因子刺激B细胞的增殖和分化,促进免疫球蛋白的合成和分泌,这种作用可能是通过IL-1诱导PBMC产生IL-6而介导的。

刺激骨髓多能干细胞的增殖:现已证实IL-1与Stanley(1986)报道的血细胞生成素-1增强NK细胞的杀伤活性:通过提高NK细胞对IL-2等细胞因子的敏感性增强其杀伤活性,IL-1与IL-2或IFN有协同刺激NK细胞活性的作用。

促进多种免疫分子的基因表达:如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、TNF-α、TNF-β、INF-β、G-CSF、GM-CSF、GM-CSF,IL-2Rα链,活化IL-2基因的启动子,诱导B细胞κ链核因子活化免疫球蛋白κ链基因,诱导NF-IL-6转录因子活化IL-6启动子。

刺激单核细胞和巨噬细胞产生IL-6和TNF,并通过单核细胞和巨噬细胞产生IL-8介导对中性粒细胞的趋化作用。此外,IL-1诱导内皮细胞活化,刺激中性粒细胞释放炎症蛋白和炎症介质,直接参与炎症发生过程。

IL-1与TNF生物学性质,尤其在非免疫性作用方面较为相似。抗TNF-α中和抗体可预防内毒素引起的休克,同时降低了IL-1和IL-6水平,表明在某些条件下,IL-1水平受到TNF的调控。

6.IL-1与临床

发热:IL-1是一种内源性热原质促进肝细胞合成急性期蛋白以及某些补体的组分,有利于机体抵抗病原微生物等,是机体非特异性防御因素之一。低剂量IL-1可提高动物对脑型和恶性疟疾的抵抗力。

对间质细胞和其它细胞的作用:类风湿关节炎关节囊内巨噬细胞受到刺激和活化后可分泌IL-1,刺激滑膜细胞、软骨细胞、成纤维细胞分泌大量PGE2、胶原酶和中性蛋白酶等,从而使关节中的胶原组织降解,骨质吸收,局部血管通透性增加,直接参与关节的病理损伤。多种关节炎的关节液中可测出高水平IL-1。IL-1还可刺激脑组织神经胶质细胞增生,形成瘢痕,与癫痫发作可能有关。此外,IL-1刺激肾小球系膜细胞增生,导致肾实质纤维化和慢性肾功衷竭。

抗肿瘤作用:由于IL-1能协同IL-2、IFN-γ诱导CTL和NK细胞的杀伤活性,促进杀伤细胞IL-2受体的表达以及成纤维细胞分泌IL-6,因此具有抗肿瘤作用。临床已试用IL-1治疗肿瘤。

抗放射作用IL-2

1976年Morgan等发现小鼠脾细胞培养上清中含有一种刺激胸腺细胞生长的因子,由于这种因子能促进和维持T细胞长期培养,称为T细胞生长因子,1979年统一命名为白细胞介素2CD4阳性或CD8阳性T细胞:有丝分裂原刺激CD4阳性或CD8阳性T细胞亚群均可产生IL-2;同种异体抗原主要刺激CD4阳性T细胞分泌IL-2。PBMC、脾脏、淋巴结和扁桃腺中的T细胞受到刺激后都能产生IL-2。在小鼠Th细胞中,只有Th1亚群可产生IL-2。

T细胞肿瘤细胞系或白血病细胞系:人和动物某些T细胞白血病细胞系或肿瘤细胞在有丝分裂原、钙离子载体或PMA刺激下可产生高水平的IL-2。如长臂猿T细胞系MLA144可自发产生IL-2,小鼠胸腺瘤细胞系EL-4和人Jurkat细胞静止状态不合成和分泌IL-2,刺激后可分泌高水平的IL-2。

T淋巴细胞杂交瘤:T淋巴细胞杂交瘤123,FS6-14.13,HT-24A等在ConA刺激下产生IL-2。

应用基因工程技术制备:1983年Taniguchi等从ConA刺激的Jurkat白血病T细胞中克隆成功IL-2cDNA,并在大肠杆菌中得到高水平的表达。目前应用基因工程技术所制备和纯化的IL-2已用于临床治疗某些肿瘤和其它疾病。

2.IL-2的分子结构和基因 人IL-2含有133氨基酸残基,分子量为15.5kDa。天然IL-2在N端含有糖基,但糖基对IL-2的生物学活性无明显影响,等电点在6.6~8.2。IL-2分子含有3个半胱氨酸,分别位于第58、105和125位氨基酸,其中58位与105位半胱氨酸之间所形成的链内二硫键对于保持IL-2生物学活性起重要作用。在IL-2基因产物的提纯和复性过程中,如二硫键配错或分子间形成二硫键都会降低IL-2的活性。现已有应用点突变,将第125号位半胱氨酸突变为亮氨酸或丝氨基,使只能形成一种二硫键,保证了在IL-2复性过程的活性。还有报道用蛋白工程技术生产新型rIL-2,将IL-2分子第125位半胱氨酸改为丙氨酸,改构后IL-2比活性比天然IL-2明显增加。人IL-2基因定位于第4号染色体,长约5kb,由4个外显子和3个内含子组成。人和小鼠IL-2基因DNA序列有63%同源性。

3.IL-2的受体 IL-2R是由α、β和γ三条链组成。

IL-2Rα链:Uchiyama(1981)首次制备了抗活化T细胞抗原Tac的McAb,与IL-2相互竞争结合到Tac阳性细胞。Tac的分子量为55kDa。1984年Leonard将Tac分子的cDNA克隆成功。Tac分子为糖蛋白,由272个氨基残基组成,包括21个氨基酸残基信号肽,成熟分子含251个氨基酸,含有多个半胱氨酸,2个N-糖基化位点,穿膜区和胞浆区分别含19和13个氨基酸残基。人Tac的基因定位于第10号染色体,包括8个外显子和7个内含子,长约25kb。Tac即为IL-2受体α链,又称CD25,是活化T淋巴细胞的标志。在骨髓移植中如除去Tac阳性供体细胞可以降低移植物抗宿主反应,现已进入Ⅱ期临床验证。也可用抗IL-2r McAb选择性地封闭、消除活化的效应细胞,从而治疗同种异体移植物排斥反应及某些自身免疫性疾病。

IL-2Rβ链:分子量70kDa,故又称p70,在人白细胞分化抗原中编号为CD122。人IL-2Rβ链基因定位于22号染色体。成熟IL-2Rβ链有525个氨基酸,5个N糖基化位点,包括胞膜外区、穿膜区和胞浆区。胞膜外区由214个氨基酸组成,有8个Cys,其结构上有1个红细胞生成素受体超家族特征性的结构域,还有1个Ⅲ型纤维粘连蛋白结构域。跨膜区25个氨基酸。胞浆区有286个氨基酸,与EPO受体胞浆区有一定的同源性。IL-2Rβ链本身无酪氨酸激酶区,但胞浆区中有两个结构域:一个是靠近膜端的丝氨酸富含区,在IL-2诱导的增殖信号传递中起重要作用;另一个是与酪氨酸激酶相联的酸性区域。缺乏酸性区域的IL-2Rβ链突变体能传导增殖信号,并诱导转录c-myc,不能介导诱导转录因子Fos的作用;缺乏丝氨酸富含区的IL-2Rβ链突变体不能诱导细胞增殖及c-myc的转录。因此,酪氨酸激酶途径似乎与c-fos 基因的诱导有关,而非激酶依赖的途径与c-myc基因的诱导有关。IL-2Rβ链主要分布于T细胞、大颗粒淋巴细胞、B细胞、pre-T细胞。

IL-2Rγ:糖蛋白,含347个氨基酸,分子量64kDa。胞膜结构特征属于红细胞生成素家族成员,胞浆区含86个氨基酸,从288~321位氨基酸序列似乎同源于src同源区2IL-2R的组成与亲和力的关系:单独IL-2Rγ链不能结合IL-2,但对于中亲和力IL-2R、高亲和力IL-2R的组成、IL-2的内化以及信号转导是必需的。X-性联重症联合免疫缺陷症病人的IL-2Rγ基因发生突变而丧失IL-2R功能。

表4-2 三种亲和力IL-2R的组成

组成亲和力,MLA144α链+β链+γ链高,10-11MPHA刺激母细胞,HUT102B2

可溶性IL-2R:可溶性IL-2R是膜结合形式IL-2Rα链的脱落物,分子量45kDa。在人类T细胞白血病Ⅰ型病毒感染的HUT102B2细胞培养上清中含有大量sIL-2R。PBMC经丝裂原、CD3McAb和同种异体抗原刺激后可释放sIL-2R。正常人血清和尿液中亦可检出少量sIL-2R。sIL-2R可能与膜表面IL-2R竞争结合IL-2,从而成为一种免疫抑制物质。sIL-2R增高可见于某些恶性肿瘤、自身免疫病、病毒感染性疾病以及移植排斥等。

4.IL-2的生物学作用 IL-2的作用具有沿种系谱向上有约束性,向下无约束性的特点,如人的IL-2能促进小鼠T细胞的增殖,而小鼠的IL-2不能维持人T细胞的生长。IL-2体内的半衰期只有6.9分钟。有报道用PEG对IL-2加以修饰,对生物学活性无影响,半衰期可延长7倍左右。目前关于IL-2的生物学作用大都是体外实验的结果。具有中和活性的抗IL-2抗体可抑制IL-2的生物学活性。

Th、Tc和Ts细胞都是IL-2 的反应细胞:IL-2对静止T细胞作用较弱。胸腺细胞和T细胞经抗原、有丝分裂原或同种异体抗原刺激活化后有在IL-2存在的条件下进入S期,维持细胞的增殖。IL-2可刺激T细胞转铁蛋白受体、胰岛素受体、MHCⅡ类抗原的表达,并产生多种淋巴因子如IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-β及CSF等。

诱导CTL、NK和LAK等多种杀伤细胞的分化和效应功能,并诱导杀伤细胞产生IFN-γ、TNF-α等细胞因子。IL-2可增强CTL细胞穿孔素直接作用于B细胞,促进其增殖、分化和Ig分泌。已发现活化的B细胞也可具有IL-2R,IL-2对B细胞的调节作用除通过刺激T细胞分泌B细胞增殖和分化因子外,还可能有直接的调节作用。

活化巨噬细胞。

5.IL-2的临床应用 目前重组IL-2已用于临床治疗肿瘤以及感染性疾病等。

抗肿瘤:IL-2在体外可诱导PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞成为淋巴因子激活的杀伤细胞。LAK/IL-2对肾细胞癌、黑素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、结肠直肠癌有较明显疗效,对肝癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、肺癌等有不同程度的疗效。近年来已开始采用IL-2基因治疗对黑素瘤、肾细胞癌以及神经母细胞瘤等肿瘤等进行临床验证。

治疗感染性疾病:动物实验结果表明,IL-2对某些因细胞免疫功能低下而受病毒感染,需增强细胞免疫功能的病人有一定疗效。IL-2本身无直接抗病毒活性,它是通过增强CTL、NK活性以及诱导IFN-γ产生而介导抗病毒感染的。目前用IL-2治疗活动性肝炎已显示出可喜的苗头,对于单纯疱疹病毒感染、AIDS病、结节性麻风、结核杆菌感染等也有一定疗效。如rIL-2明显延长结核杆菌H37RV株感染小鼠和豚鼠的半数死亡时间,降低死亡率,减少感染动物脾、肺组织内的结核杆菌数。

免疫佐剂作用采用IL-2白喉毒素融合蛋白治疗类风湿性关节炎进入Ⅰ/Ⅱ期临床验证,约有74%患者病情得到改善,IL-2融合毒素主要作用于CD4阳性淋巴细胞,有较好的选择性。

rIL-2体内大剂量使用毒性作用较大,可引起毛细血管渗漏综合征。此外,IL-2半衰期短,有时还可在体内诱导产生一定抗体。

美国Immunex应用抗IL-2Rα链McAb预防骨髓移植后GVHR进入Ⅱ期临床试验。

IL-3

见本节集落刺激因子。

IL-4

1982年Howard发现T细胞培养上清中有一种促进B细胞增殖的因子,起初命名为B细胞生长因子-1。1986年基因克隆成功,国际统一命名为白细胞介素4由800氨基酸残基组成,分子量为140kDa,胞膜外区207氨基酸,跨膜区24氨基酸,胞浆区569氨基酸,与小鼠IL-4R有53%同源性,属于红细胞生成素受体超家族成员,最近命名为CDw124。在小鼠,T细胞、B细胞、胸腺细胞、骨髓细胞、巨噬细胞和肥大细胞表面都有IL-4R,每个细胞受体数目在100~2000左右,其亲和力Kd在10-10~10-11M,1~5×10-12M浓度的IL-4可使B细胞增殖达到最大值的50%。LPS对B细胞IL-4R表达有正调节作用,受体数量可增加5~10倍。IL-4与相应受体结合后细胞内传递信号的途径尚不清楚,IL-4R胞浆区富含苏氨酸和丝氨酸,PTK和PKC可能参与受体介导的信号传递,IP3和Ca2+浓度升高。在小鼠发现有不同剪接形式mRNA所翻译的分泌型IL-4R(sIL-4R)。sIL-4R与膜型IL-4R同配体IL-4结合时具有相同的亲和力。sIL-4R可能是IL-4保护性载体,或调节IL-4的生物学活性。

4.IL-4的生物学活性 IL-4对于B细胞、T细胞、肥大细胞、巨噬细胞和造细胞都有免疫调节作用。

B细胞:促进SAC或抗IgM预先刺激B细胞的增殖,这一生物学功能已被用来作为检测IL-4的生物学活性。IL-4促进B细胞MHCⅡ类抗原、FcεRⅡ/CD23和CD40的表达,并增强B细胞提呈抗原能力,使免疫系统对小量抗原刺激发生免疫应答。增加FcεRⅡ/CD23的表达,并释放可溶性CD23/IgE结合因子,与mIgE阳性细胞结合并诱导其分化,可能与促进B细胞IgE的产生有关。IL-4提高LPS刺激小鼠B细胞IgG1、IgE产生水平分别为8~10倍和10~100倍,但对IgG3分泌降低6~10倍,IgG2a、IgG2b和IgM有不同程度下降,对IgA产生无明显影响。IL-4增强IgG1和IgE水平的机理可能是:①使选择性刺激定向产生IgG1或IgE的B细胞的增殖和分化;②增加特异的重链稳定区Ig类的转换区Sμ-Sγ1结合,促进IgG1合成和分泌。IFN-γ对IL-4上述生物学功能有明显抑制作用。而IL-4则可抑制IFN-γmRNA的转录和抑制IFN-γ诱导B细胞产生IgG2a。寄生虫感染时血清IgG1和IgE水平升高。此外,IL-4还可促进休止期B细胞的早期活化,从Go期进入G1期,细胞体积增大,并表达CD25。

T细胞:IL-4是T细胞自身分泌的生长因子,如HT-2细胞系是一种IL-2依赖细胞系,IL-4可单独维持TH-2的增殖,抗IL-2和抗IL-4McAb可分别抑制IL-2和IL-4刺激IL-2细胞的增殖作用,但相互之间无交叉抑制作用。纯化后的T细胞对IL-4的增殖反应还需要IL-1的协同作用;而IL-2单独可维持活化T细胞的增殖。表明IL-4生长信号的传递过程与IL-2有所不同。高剂量IL-4能诱导CD4-CD8+或CD4+CD8-或CD4-CD8-胸腺细胞的增殖。IL-4增强PHA刺激T细胞释放GM-CSF和G-CSF。在小鼠实验系统中,多数情况下IL-4对CTL和LAK细胞的分化有正调节作用;而对人的杀伤细胞则有时表现为负调节作用,如在人MLC中IL-4选择性地促进Th增殖,同时伴有CTL、NK和LAK功能的降低。此外IL-4还能抑制IL-2所诱导的NK白血病细胞LAK活性。最近发现,用IL-4与T细胞或B细胞温育,可降低高亲和力IL-2R位点数,但不影响低亲和力IL-2R的数量。IL-4还可刺激CD3阴性NK细胞克隆和生长。

刺激肥大细胞增殖,并与IL-3有协同作用,尤其对于粘膜和结缔组织型肥大细胞体外生长是必需的。

促进巨噬细胞提呈抗原和杀伤肿瘤细胞的功能,可能与调节MHCⅡ类抗原和FcR表达有关。IL-4与GM-CSF、IL-3和LPS有协同作用。IL-4可诱导外周血单核细胞分泌G-CSF和M-CSF,增强中性粒细胞介导的吞噬、杀伤活性和ADCC作用。IL-4是小鼠巨噬细胞趋化因子,并促进IL-1ra产生,但抑制单核细胞IL-1、TNF和IL-6的产生。

协同CSF刺激造血细胞的增殖,与G-CSF协同增强粒细胞集落形成,协同红细胞生成素增强BFU-E的形成。

IL-4作为肿瘤免疫调节剂已进入Ⅱ期临床试验。此外,还开始进行治疗免疫缺陷症的临床试验。由于体内、体外均证实IL-4可以抑制IL-1、IL-6和TNF分泌,并促进IL-1ra 产生,因此应用IL-4可能为治疗败血症休克提供一种新的方法。

IL-5

1980年Takatsu等发现在T细胞条件培养液中,含有一种因子能替代T细胞在体外协同胸腺依赖抗原的抗体应答,称为T细胞替代因子,嗜酸性粒细胞集落刺激因子和嗜酸性粒细胞分化因子相同,人IL-5Rβ链是与IL-3Rβ链、GM-CSFRβ是共同的。由于mRNA剪接的不同,已发现有二种可溶性小鼠IL-5Rα链,其中一种可抑制IL-5与膜结合IL-5R的结合。人和鼠IL-5Rα链有79%的同源性。

4.IL-5的生物学活性 与其它IL相比,IL-5生物学活性作用谱相对较窄。

小鼠IL-5促进抗原刺激的B细胞分化为抗体合成细胞,主要作用于进入细胞增殖后期的B细胞,并增加活化B细胞IL-2R的表达,IL-5的这种刺激作用与人IL-6功能相似,人IL-5只作用于B细胞刺激后很窄的时相内。

促进IgA合成,其机理可能是:①作为IgA特异性启动因子,使mIgM 阳性B细胞分化为mIgA阳性B细胞;②作用于IgA型B细胞,促进其增殖和分化,成为分泌IgA的浆细胞。IL-4有协同IL-5促进IgA合成的作用。IL-5对IgM的分泌也有促进作用。

协同ConA或IL-2诱导胸腺中杀伤性T细胞前体分化为CTL。

趋化人嗜酸性粒细胞,延长成熟嗜酸性粒细胞的存活时间,刺激人和小鼠嗜酸性粒细胞的功能,诱导嗜酸性粒细胞的分化。

IL-6

1980年发现成纤维细胞经Poly I-C刺激后能产生一种抑制病毒复制的细胞因子,称为β2干扰素。以后的研究结果未能证实这种因子的直接抗病毒作用,但具有其它多方面的生物学功能,根据实验系统和功能的不同,不被命名为杂交瘤/浆细胞瘤生长因子T细胞:T细胞产生IL-6依赖于巨噬细胞或PMA。抗原提呈细胞刺激相应的T细胞克隆,以及HTLV-I感染的T细胞系等均可分泌IL-6。

B细胞:如SAC刺激而活化的B细胞。

单核细胞:LPS刺激单核细胞产生IL-6,某些单核细胞系如P388D1也可分泌IL-6。

成纤维细胞:可自发产生IL-6,其它因子或刺激物如IL-1、TNF、PDGF、IFN-β、PolyI-C、A23187、PMA等可促进IL-6的产生。

肾小球系膜细胞、角朊细胞、内皮细胞等在一定培养条件下均可产生IL-6。此外,肿瘤细胞或细胞系如MG63成骨肉瘤,T24膀胱癌、A549肺癌、7860肾癌、SK-MG-4神经胶质母细胞瘤、U373星状细胞瘤、心脏粘液瘤细胞和骨髓瘤细胞等也能分泌IL-6。最近发现垂体前叶中的滤泡—星状细胞识别一段特殊的14bp,ACATTGCACAATCT。多反应元件位于c-fos SRE同源区内,这个区域对IL-1、TNF、forskolin和PMA诱导IL-6产生有关;与IL-1、TNF刺激IL-6产生有关的NF-κB位于TATA盒的上游。

人IL-6分子由212个氨基酸残基组成,包括28个氨基酸残基的信号序列,成熟IL-6为184氨基酸残基,分子量26kDa。IL-6分子由4个α螺旋和C端受体结合点所组成,其中179位精氨酸残基对于与受体的结合非常重要。分子中糖基对生物学活性功能并非必需,N端23个氨基酸残基虽不直接与IL-6生物学活性有关,但对整个IL-6分子组成起稳定作用。人IL-6氨基酸序列与小鼠IL-6有42%同源性,人的IL-6对小鼠某些细胞有刺激作用。IL-6与G-CSF和IFN-β有较高同源性,对骨髓造血细胞和髓样白血病细胞的某些作用也有相似之处。

3.IL-6的受体 目前已知,IL-6R至少由称之为IL-6结合受体蛋白和称为信号转导蛋白的gp130所组成,习惯上前者称之IL-6R。

IL-6R:人IL-6R由468个氨基酸组成,切除N端19个氨基酸残基后的成熟分子有449氨基酸,胞膜外区、穿膜区和胞浆区分别为339、28和82个氨基酸,分子量为80kDa,6个N糖基化位点。胞膜外由一个Ig样区、2个Ⅲ型纤维结合蛋白结构及1个细胞因子受体的同源区所组成,后者含4个保守的Cys和一个WSXWS结构。单独IL-6R与IL-6结合为低亲和力。IL-6R分布于淋巴样细胞和非淋巴样细胞,如活化B细胞、EBV转化B细胞、急性淋巴母细胞白血病细胞、骨髓瘤细胞、静止T细胞、肝细胞、单核细胞、急性髓样白血病细胞、嗜铬细胞瘤细胞等。

gp130(CDw130):分子量为130kDa的糖蛋白,共有14个潜在N-糖基化位点,胞膜外区、穿膜区和胞浆区分别有597、22和277个氨基酸。胞膜外区有1个IgC2区,6个Ⅲ型纤维结合蛋白的结构,其中第二个和第三个结构区之间有4个保守的Cys和WSXWS结构的区域,形成1个细胞因子受体家族结构特征的结构域。gp130不能直接与配基IL-6结合,在生理情况下,IL-6与IL-6受体结合后使IL-6R的构象发生变化并迅速与两个gp130分子结合,形成高亲和力的结合位点,并通过gp130亚单位传递信号。人和小鼠gp130在氨基酸水平上有77%的同源性。转染gp130cDNA小鼠pro-B细胞在IL-6/sIL-6R复合物刺激下可传递增殖信号。小鼠体内注射IL-6可增加gp130mRNA的表达。目前已证实,gp130除组成IL-6高亲和力受体外,也是白血病抑制因子、抑瘤素M、睫状神经营养因子和IL-11等受体所共用的亚单位。

信号转导:gp130与IL-6/IL-6R复合物结合后,刺激gp130胞内部分发生酪氨酸磷酸化,目前关于参与此过程的酪氨酸蛋白激酶的作用还不清楚。酷氨酸激酶被激活后继而引起丝氨酸/苏氨酸激酶如丝裂原活化的蛋白激酶sIL-6R:存在于正常人尿、骨髓瘤细胞系U266培养上清,PHA活化人PBMC以及HTLV-I阳性细胞也能分泌sIL-6R,分子量为50kDa。用反转录PCR从正常人细胞和骨髓瘤细胞中均分离出编码sIL-6r mRNA,序列分析表明与膜结合受体相应区域序列一致。sIL-6也可从膜结合的sIL-6R可抑制sIL-6R/IL-6复合物的活性。sIL-6R水平的升高与某些自身免疫性疾病有关。

4.IL-6的生物学活性

刺激细胞生长:IL-6可促进多种细胞的增殖,如B淋巴细胞杂交瘤、浆细胞瘤、EBV转化的B细胞、T细胞、PMA和IL-4刺激的胸腺细胞、造血干细胞、角朊细胞和肾小球系膜细胞。

促进细胞分化:如B细胞分化和Ig的分泌,CTL分化,协同IL-2增强CTL中穿孔素基因的表达,并增加T细胞IL-2产生和IL-2R表达,诱导异巨噬细胞、神经细胞和NK细胞分化。协同IL-3促进干细胞分化和巨核细胞的成熟。明显促进小鼠骨髓移植后免疫功能的重建。

图4-2 IL-6受体信号传递的模式图

加速肝细胞急性期蛋白抑制M1髓样白血病细胞系的生长,促进其成熟和分化;抑制黑素瘤、乳腺癌细胞生长。

5.IL-6与临床 IL-6与临床上多种疾病的发生有一定的关系。

IL-6与自身免疫性疾病

①心脏粘液廇:患者往往表现为高丙球蛋白血症,有多种血身抗体以及急性期蛋白升高。培养的粘液瘤细胞含有IL-6和IL-6mRNA,患者血清中IL-6明显升高,骨髓中可见有IL-6依赖的多克隆浆细胞增殖。手术后上述症状和体症可见逐渐消退。

②Castleman氏病:患者表现为高丙球蛋白血症,急性期蛋白和血小板升高,增生的淋巴结生发中心中B淋巴样细胞产生IL-6,其中某些患者可发展成为多发性骨髓瘤。

③类风湿性关节炎:表现为多克隆性浆细胞增多症,自身抗体、C反应蛋白和血小板升高。急性期血清以及关节的滑液中能测到IL-6,滑液中IL-6与IgG以及血清中IL-6与C反应蛋白之间有明显的相关性。患者的T细胞、B细胞、滑膜细胞以及软骨细胞均可产生IL-6。

④艾滋病:与艾滋病患者多克隆B细胞活化有关,HIV感染诱导单核细胞产生IL-6可能引起血清中IL-6水平的升高。此外,IL-6可能是Koposi氏肉瘤的主要生长因子之一,反义IL-6基因在体内可抑制Koposi氏肉瘤细胞的生长。

IL-6与肿瘤

①浆细胞瘤形成:慢性炎症诱导IL-6生物合成增加与浆细胞瘤的发生有关。如用石腊或降植烷腹腔刺激小鼠,诱导炎症,可诱导出较高比例的浆细胞瘤。在患者也可见到类似情况,如早先发生的类风湿性关节炎可能与浆细胞瘤形成有关。在体外,IL-6可促进浆细胞瘤和骨髓瘤细胞的生长,某些浆细胞瘤细胞生长依赖于IL-6的存在。

②可能通过自分泌机理与非Hodgkin氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和急性髓样白血病的发病有关。血清中IL-6水平与多发性骨髓瘤如浆细胞白血病病情严重程度有关。多发性骨髓瘤患者不仅骨髓细胞表面IL-6R表达增加,而且血浆中sIL-6R水平明显升高。

IL-6与膜增生性肾小球肾炎烧伤和术后伴有血清IL-6水平增加。

病毒性脑膜炎和脊髓膜炎小鼠的胶质细胞可分泌大量IL-6,IL-6又可促进脑胶质细胞分泌其它神经营养因子和神经生长因子。

IL-6作用于下丘脑-垂体-肾上腺轴,刺激ACTH和皮质激素的释放以及星状细胞合成内啡肽。

IL-1和TNF-α对IL-6引起的病理损伤可能有协同作用。

应用IL-6治疗放疗、化疗所致血小板减少症、癌症以及作为疫苗佐剂已进入临床试验。

IL-7

1982年Whitlock建立了骨髓长期培养系统,或小鼠前B细胞生长因子和低亲和力B细胞:刺激Pre~B细胞的生长,TGF-β对此有抑制作用,但不被抗IL-4、抗IL-6McAb以及抗IL-2R、IL-3R和IL-5R的McAbs所抑制。对骨髓中淋巴干细胞的分化可能也有刺激作用。纯化IL-7在10-13M即可刺激IXN/2b细胞增殖。

胸腺细胞:促进胸腺中CD4-CD8-和CD4+CD8+细胞亚群的增殖。

T细胞:促进混合淋巴细胞培养或PMA刺激T细胞的增殖,协同ConA刺激T细胞产生IL-2以及IL-2R和ICAM-1的表达。IL-7诱导T细胞增殖可通过IL-2依赖和不依赖两种途径。

诱导人PBMC产生LAK活性,加入IL-2抗血清对LAK活性无显著变化,表明IL-7这种诱导LAK活性作用不依赖IL-2,IL-7诱导LAK的前体细胞主要来血PBMC中的NK。IL-4对这种诱导作用有抑制效应,抗IL-4抗血清可使IL-7诱导LAK活性提高4~10倍。

IL-8

见本节趋化因子。

IL-9

1988年Uyttenhove等报道了一种来自小鼠T细胞的细胞因子,能支持某些Th细胞克隆的生长,分子量在30~40kDa,又称T细胞生长因子-Ⅲ产生,PHA或抗CD3McAb、Ca2+载体可诱导T细胞分泌IL-9,PMA有协同作用。PMA和Ca2+载体刺激人PBMC可转录大量IL-9mRNA。此外,HTLV-I转化的T细胞株C5MJ2细胞、肥大细胞也可产生IL-9。目前还没有检测到静止T细胞或活化B细胞中有IL-9mRNA的表达。

2.IL-9的分子结构和基因 人和小鼠IL-9基因结构相似,在DNA水平上有67%同源性。人IL-9基因由5个外显子和4个内含子组成,基因长约4kb,与IL-3、IL-4、IL-5、M-CSF、GM-CSF、c-fms、PDGFR基因位于第5号染色体中,在小鼠位于13号染色体。IL-9基因5′非翻译区含有TATA盒以及活化蛋白位点和糖皮质激素反应元件等识别位点。小鼠IL-9分子的前体由144个氨基酸残基组成,含18个氨基酸残基的信号肽。人成熟IL-9由126个氨基酸残基组成,分子量为14.2kDa。人和小鼠IL-9在氨基酸水平的56%同源性。均含有10个保守的半胱氨酸,在生理情况下可能形成复杂的二硫键。IL-9为碱性蛋白,有多个N糖基化点。

3.IL-9受体 IL-9R结构上属于红细胞生成素受体超家族,与配体结合为高亲和力。小鼠IL-9R含468个氨基酸,人IL-9R为553个氨基酸,两者有53%同源性。在小鼠已发现有缺乏空膜区和胞浆区的可溶性IL-9受体维持T细胞生长,为一种自分泌生长因子,因此又称为T细胞生长因子-Ⅲ。由于抗CD3McAb能诱导IL-9产生,故推测IL-9对T细胞抗原刺激后启动的免疫应答有重要调节作用。

IL-9对于IL-4诱导PBL中正常B细胞IgG、IgE和IgM的产生有促进作用。

小鼠IL-9协同IL-3或IL-4刺激骨髓来源肥大细胞的增殖,并诱导其产生IL-6。

刺激巨核母细胞白血病细胞的生长。此外,人和鼠IL-9均可与EPO协同,支持体外骨髓细胞红细胞系的爆发形成单位的产生。IL-9单独能支持BFU-E的短期存活。

IL-9可能与Hodgkin氏病的发生有关。原代或传代培养的Hodgkin氏瘤和Reed-Sternberg细胞表达IL-9和IL-9R。

IL-10

1989年美国DNAX研究所Fiorentino等发现小鼠Th2细胞株D10.G4.1产生一种新的细胞因子,能抑制Th1细胞株细胞因子mRNA的转录,称为细胞因子合成抑制因子,同年命名为白细胞介素10。

1.IL-10的产生 抗原或丝裂原刺激小鼠Th2细胞株D10.G4.1以及CDC25、CDC35、D9、MB2-1等细胞可分泌IL-10。在小鼠,活化胸腺细胞、巨噬细胞、角朊细胞、Ly1+和正常B细胞也可产生IL-10;在人类,某些CD4+T细胞克隆、来自AIDS病人B细胞系、EBV感染的淋巴母细胞、Burkitt氏淋巴瘤、活化单核细胞、外周血T细胞均可产生IL-10。

2.IL-10的分子结构和基因 小鼠和人IL-10基因都定位于第1号染色体,其基因组包括5个外显子和4个内含子,并可能有NF-κB和AP-1的结合位置。人和小鼠IL-10在DNA和氨基酸水平上分别有81%和73%的同源性。DNA序列分析表明,IL-10与EB病毒基因组中开放读框区I有70%左右的同源性。有人把BCRF-I的基因产物称为病毒IL-10,提示EBV可能摄取了哺乳动物IL-10的基因,以求自身的生存。如EBV感染过程中通过产生vIL-10抑制宿主细胞IFN-γ产生,保持EBV在宿主细胞内生存和繁殖。Moore等已克隆成功IL-10cDNA,并在COS7细胞中得到表达。人和小鼠IL-10均含178个氨基酸残基,内有18氨基酸信号肽系列,裸肽分子量18.7kDa,PI8.1。成熟IL-10分子为160氨基酸残基,小鼠和人IL-10分子中分别含5个和4个半胱氨酸残基,由于不同糖基化可使分子量有所差别,在35~40kDa之间,酸性条件下不稳定,在溶液中呈非共价连接的同源双体。人IL-10可作用于小鼠源性细胞,而小鼠IL-10对人的细胞则无作用。

3.IL-10的生物学功能

(1)抑制小鼠Th1细胞的增殖以及IL-2、IL-3、IFN-γ、TNF以及GM-CSF等细胞因子合成。其作用机理可能是IL-10作用于APC细胞,降低其MHCⅡ类抗原的表达,或诱导APC细胞产生另一种细胞因子,改变细胞内信号的传递途径,从而选择性抑制某些细胞因子mRNA转录。IL-10可抑制人TH0、TH-1、TH-2样T细胞克隆的增殖。

促进肥大细胞和胸腺细胞增殖,IL-10也是淋巴结、脾脏细胞生长的复合因子协同IL-2诱导ConA活化脾细胞中CTL前体细胞提高B细胞的存活率,促进B细胞的增殖、MHCⅡ类抗原表达以及Ig的分泌,并与Th2所产生的IL-4、IL-5有协同作用。

抑制NK细胞因子的产生。

IL-10的拮抗剂可能具有抗EB病毒的作用;而IL-10通过促进单核细胞表达IL-1ra而可能成为抗炎症的治疗手段,动物实验表明,IL-10可有效地避免LPS诱导小鼠休克而造成的死亡。

IL-11

IL-11最初由Paul等在灵长类动物骨髓基质细胞株Pu-34培养上清发现的。这种生长因子可刺激IL-6依赖的小鼠浆细胞瘤细胞系T1165.85.2.1的生长,即使在有中和活性抗IL-6McAb的存在,仍有这种刺激作用,以后证实这种因子与脂肪形成抑制因子促进B细胞抗体的生成,这一作用依赖于CD4T细胞的存在。体内实验证明,IL-11可使小鼠脾脏抗原特异性PFC水平和血清中特异性抗体升高。

促进某些IL-6依赖细胞株如TF-1的生长,IL-11与IL-6可诱导靶细胞产生相似的蛋白酪氨酸磷酸化以及原癌基因jun-B的表达。

与IL-3、IL-4协同作用于骨髓造血干细胞,缩短干细胞Go期。

与IL-3等协同促进骨髓巨核细胞体外集落形成、生长和成熟,并增加细胞体积,增加外周血血小板的数量。

IL-11对小鼠骨髓和胎儿肝脏来源的不同分化阶段红系祖细胞具有刺激作用,在早期阶段需要与IL-3或SCF协同,而在分化晚期,IL-11单独可促进CFU-E的成熟。

诱导肝细胞急性期蛋白合成。

抑制脂蛋白脂酶。

小鼠体内应用IL-11可诱导抗体产生细胞的产生,血小板升高,增加骨髓来源CFU-GM、BFU-E、CFU-GEMM祖细胞细胞周期的速率。在骨髓抑制的小鼠中,IL-11可促进外周血中血小板、红细胞和粒细胞的数量。在骨髓移植小鼠中,IL-11可明显促进外周血中性粒细胞和血小板水平的恢复。

IL-12

1982年Wagner等发现在丝裂原刺激小鼠淋巴细胞的条件培养液中存在一种不同于IL-2的细胞因子,这种细胞因子在体外能与IL-2协同促进鼠CTL应答。1986年在人混合淋巴细胞培养或PHA活化的PBMC培养上清中也发现了与此类似的因子,称为CTL成熟因子MLC或丝裂原活化的PBMC培养上清。

PMA与钙离子载体A23187联合刺激EBV转化的B淋巴样母细胞RPMI8866可产生较高水平的IL-12。

2.IL-12的分子结构和基因 IL-12是由二硫键联接的异源双体,两个亚单位的分子量分别为35kDa和40kDa,等电点在pH4.5~5.5。从高产IL-12的人B淋巴样母细胞亚克隆NC37.98基因文库中克隆了IL-12cDNA,转染COS细胞获得高表达。人IL-12P35亚单位有197个氨基酸残基,含7个半胱氨酸和3个N糖基化位点,P40亚单位306个氨基酸残基,有10个半胱氨酸,4个N-糖基化位点。小鼠IL-12P35有193个氨基酸残基,与人IL-12P35有66%同源性,P40有313个氨基酸残基与人P40有70%同源性。在生理情况下,亚单位中的半胱氨酸残基之间可能形成复杂的分子间二硫键结构。两个亚单位是由不同的基因所编码,基因转染试验结果表明,只有将编码两个亚单位cDNA同时转染才能获得有生物学活性的IL-12。P35与IL-6和G-CSF有同源性,P40与IL-6受体、睫状神经营养因子受体、G-CSF受体有同源性,具有细胞因子受体家族的特征。提示IL-12分子可能是一种细胞因子/可溶性细胞因子受体复合物。在RPMI8866细胞系中纯化到的自然杀伤细胞刺激因子结合为低亲和力,Kd为2~6nM,PBMC表面有IL-12高亲和力受体,Kd约100pM,目前与IL-12R亚单位组成高亲和力的另一个亚单位尚未确定。IL-12P35亚单位、P40亚单位和IL-12R亚单位分别与IL-6、IL-6R和gp130有很高的同源性,而且相互结合的模式也十分相似,即IL-12P35同P40形成异源双体后可同双体或寡聚体的IL-12R亚单位结合,而IL-6同IL-6R受体结合后可同gp130二聚体结合。IL-12受体分布于PHA活化的CD4+、CD8+T细胞亚群以及IL-2活化的CD56+NK细胞,1000~9000IL-12结合点/细胞。

4.IL-12的生物学功能 人IL-12作用有种属特异性,人IL-12对小鼠细胞作用甚微。

与IL-2协同诱导CTL的分化,促进同种异体CTL反应。

刺激PHA活化CD3+T细胞增殖。IL-12诱导T细胞最大增殖水平低于IL-2的增殖刺激作用,但刺激50%最大增殖所需细胞因子浓度远低于IL-2。IL-12这种增殖作用所经途径与IL-2、IL-4和IL-7的刺激作用不同,因为针对IL-2、IL-2R、IL-4和IL-7的单克隆抗体不能阻断IL-12的增殖作用;IL-12单克隆抗体对IL-2、IL-4和IL-7诱导增殖亦无阻断作用。IL-12对静止PBMC不具有增殖作用,这一性质与IL-4相似。但IL-12与亚适剂量IL-2可协同诱导静止PBMC增殖。其机理可能是:①IL-12促进IL-2诱导T细胞IL-2r P55的表达,提高PBMC对IL-2的反应性;②IL-2促进PBMC某些亚群IL-12R表达;③在IL-2存在的条件下,IL-12可提高IFN-γmRNA转录水平,增加其稳定性,促进分泌IFN-γ,如小鼠IL-12可诱导Th1细胞产生IFN-γ。此外,IL-12通过诱导产生的IFN-γ激活巨噬细胞,诱导其TNF-α的分泌。IL-12可诱导Th1亚群的形成,此作用可能通过两种途径:①IL-12直接作用于Th1亚群;②IL-12刺激T细胞、NK细胞产生IFN-γ诱导Th1亚群形成。

协同IL-2诱导CD56+NK细胞增殖以及LAK细胞产生,促进ADCC功能,NKSF释放,诱导CD56、CD2、CD11a、IL-2R、TNFR、LFA-1和ICAM-1等分子的表达。

促进B细胞Ig产生和Ig类型转换,由IgM转为IgG,抑制IL-4诱导B细胞IgE合成。这种抑制作用是T细胞依赖的,其作用机理与IFN-γ、TGF-β和IL-8抑制IgE产生的机理可能有所不同。

IL-12发挥生物学效应所需的细胞因子浓度很低,与亚适剂量IL-2联合应用可降低IL-2用量,同时提高CTL、NK、LAK的杀伤活性,因此IL-12可能成为一种新的抗肿瘤生物制剂。

IL-13

1993年Minty等报道了白细胞介素12cDNA克隆获得成功。IL-13主要由活化T细胞产生,抗CD28抗体可诱导IL-13mRNA表达;在小鼠IL-13由Th2亚群产生。

1.IL-13的分子结构和基因 人IL-13基因定位于5号染色体,由4个外显子和3个内含子组成。人和小鼠IL-13在基因水平上有66%同源性。人IL-13分子有132个氨基酸,切除18个氨基酸的信号肽后,成熟IL-13分子为114个氨基酸,非糖基化IL-13分子量为12.4kDa,糖基化后为17kDa,与小鼠IL-13有58%同源性。IL-13基因与IL-4基因连锁,在氨基酸水平上有20%~25%同源性。

2.IL-13的生物学活性

趋化单核细胞,延长单核细胞在体外存活时间,抑制LPS诱导单核细胞、巨噬细胞IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等炎症因子产生。

协同抗IgM活化B细胞的增殖,诱导和上调B细胞MHCⅡ类抗原、CD23和CD72的表达,诱导B细胞产生IgM、IgG和IgE。

诱导大颗粒淋巴细胞产生IFN-γ,并可与IL-2协同刺激LGL产生IFN-γ,因而在诱导LAK活性以及Th1型细胞免疫中可能有重要作用。

IL-14

白细胞介素14又称高分子量B细胞生长因子IL-15

Grabstein等首先在猴肾表皮细胞系CV-1/EBVA上清中发现一种能维持CTLL增殖的因子,随后基因克隆获得成功并命名为白细胞介素15的增殖,诱导CTL和LAK细胞的产生。IL-15的刺激作用需要有靶细胞的IL-2受体β和γ链的参与,但不需要IL-2受体的α链。

表4-3 白细胞介素种类和主要生物学活性

IL主要产生细胞氨基酸数目分子量促进胸腺细胞、T细胞活化、增殖和分化 巨噬细胞IL-1β15317.5增强CTL和NK杀伤活性 协同IL-4刺激B细胞增殖、分化和Ig产生 协同CSF促进造血功能 刺激干细胞产生SCFIL-2活化T细胞13315.5促进活化 T细胞增殖、分化和细胞因子产生 增强CTL、NK和LAK杀伤活性 促进B细胞增殖、分化和抗体分泌 活化巨噬细胞IL-3活化T细胞13315促进多能干细胞、定向祖细胞、髓样、红样、巨核、前单、单核、中性、嗜酸、肥大细胞增殖和分化 促进T细胞增殖 增强外周血PMN、Mo、Eo的数量,促进Eo的ADCCIL-4活化T细胞促进活化B细胞增殖、Ig产生和类别转换为IgE和IgG1 T细胞生长因子 促进肥大细胞增殖 增强巨噬细胞功能 协同CSF刺激造血细胞IL-5活化T细胞115×245诱导B细胞分化为抗体分泌细胞、IgA合成 协同IL-2促进CTL分化 促进人Eo激活、增殖和分化IL-6单核细胞

巨噬细胞18426刺激T细胞、B细胞、杂交瘤细胞和干细胞增殖 成纤维细胞 促进B细胞Ig产生 促进CTL、NK干细胞和巨核细胞分化IL-7骨髓和胸腺15225刺激B细胞前体、前B细胞的增殖 中基质细胞 促进前T细胞、胸腺细胞和T细胞增殖 诱导LAK活性IL-8单核细胞69,72,77,8-10趋化中性、嗜碱性粒细胞和T细胞 内皮细胞79 IL-9活化T细胞 14.2T细胞生长因子 126 协同IL-3刺激肥大细胞IL-10活化T细胞2×16035~40抑制Th1细胞分泌细胞因子 促进胸腺细胞和肥大细胞增殖 协同IL-2促进CTL分化IL-11基质纤维样17823促进B细胞抗体分泌 细胞 促进浆细胞瘤生长 协同IL-3等刺激骨髓干细胞和巨核细胞生长IL-12B细胞197/30635/40协同IL-2促进CTL、NK、LAK分化 促进PHA活化T细胞增殖 促进B细胞Ig产生和类型转换IL-13活化T细胞13217刺激B细胞增殖和CD23表达 抑制单核-巨噬细胞炎症性细胞因子产生IL-14活化T细胞468-刺激活化B细胞增殖 抑制丝裂原诱导的B细胞Ig的分泌

二、集落刺激因子、巨噬细胞CSF、粒细胞和巨噬细胞CSF、多重集落刺激因子、干细胞因子、红细胞生成素。有人将IL-5称为嗜酸性粒细胞集落刺激因子IL-3

1981年Ihle等发现ConA刺激小鼠脾细胞的培养上清中含有一种因子,能提高裸鼠脾脏淋巴细胞成熟淋巴细胞标志20-α-羟固醇脱氢酸的阳性率,命名为白细胞介素3位于-301处,CREB位于-147处,NFAT-1位于-156处,CK-1位于-126处,CK-2位于-115处。hIL-3转录调控主要受上游两个顺式调控区的调控。第一个位于-121到-161之间,它对于hIL-3转录激活最为重要,其间除含有CREB、NFAT-1外,新发现了对hIL-3表达起决定作用的转录调控蛋白结合位点,该位点被命名为NF-IL-3-A。第二个调控区位于-301处的AP-1位点,AP-1位点能强有力地增强hIL-3基因的转录。此外,最近还发现了hIL-3转录抑制调控区,位于-250和-271之间,称为NIP位点。目前认为位于其上游-301处AP-1对hIL-3的转录增强作用是通过消除NIP对hIL-3基因转录的抑制来实现的。

人IL-3以及IL-4、IL-5、IL-13、GM-CSF、M-CSF、M-CSF受体、PDGFR、β2-肾上腺素能受体、内皮细胞生长因子和CD14的基因都定位于第5号染色体。这种在一定区域内连锁的现象可能与协同调节造血过程有关,并可能与骨髓发育异常综合征GM-CSF

1977年Burgess等从小鼠肺条件培养液中发现一种能刺激粒细胞和巨噬细胞形成集落的因子,命名为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子人与鼠活性交叉糖基化G-CSF25 30Mo,En,Fb髓样、中性粒细胞集落增殖、分化成熟PMN的吞噬和杀伤功能,ADCC增加化疗作用,艾滋病,白血病,再生障碍性贫血、癌症,骨髓移植FDA已批准17q11~q135/473+0-M-CSF

70 45Mo、En、Fb前单核、单核M

吞噬和细胞毒功能,ADCC,促进IL-1、TNF-α的产生Ⅰ期临床试验5q23~q31 80+N-GM-CSF23 22Tact、Fb、En、Mo多能干细胞、髓样干细胞、单核、嗜酸、中性粒细胞增殖增加M

、Mo、PMN、Eo的数量,提高吞噬功能二次化疗所致中性粒细胞减少症,异体和自体骨髓移植,再生障碍性贫血,烫伤骨髓功能衰竭,血小板减小FDA已批准5q23~q314/354-N-IL-3肝细胞干细胞、造血祖细胞、髓系、红系、巨核细胞系干细胞增殖和分化,与IL-3、G-CSF、GM-CSF和EPO有协同作用癌症Ⅰ期临床试验 80

Mo:单核细胞;M

:巨噬细胞;Eo:嗜酸性粒细胞;En:内皮细胞;Fb:成纤维细胞;Tact:活化T细胞

表4-5 产生GM-CSF的细胞和刺激物

细胞种类刺激物生理性GM-CSF主要来源 T淋巴细胞抗原、外源凝集素、CD28McAb、IL-1、HTLVB淋巴细胞LPS、TPA巨噬细胞LPS、FCS、吞噬作用、粘附作用成纤维细胞TNF、IL-1、TPA内皮细胞TNF、IL-1、TPA、修饰的LDL间皮细胞EGF+TNF成骨细胞PTH、LPS病理性GM-CSF主要来源 AMLTNF、粘附、IL-1类风湿性关节炎滑膜 实体瘤

注:PTH:甲状旁腺激素

2.GM-CSF的分子结构和基因 人和鼠GM-CSF基因DNA序列有高度同源性,基因组约2.5kb长,包括4个外显子和3个内含子。小鼠GM-CSF基因位于11号染色体。在人则位于第5号染色体长臂,在IL-3基因下游9kb处,此外,人的IL-4、IL-5、M-CSF、M-CSF受体。

表4-6 人第5号染色体上某些生长因子、受体和CD抗原的基因

细胞因子IL-3、IL-4、IL-5、IL-13M-CSF、GM-CSF、ECGF受 体M-CSFRmRNA。

13.GM-CSF的生物学活性 GM-CSF有多种生物学活性。

表4-7 GM-CSF的生物学活性

体外实验 刺激细胞增殖骨髓细胞,粒细胞,巨噬细胞祖细胞,红样,巨核细胞祖细胞,AML,白血病细胞系,BFU-E,内皮细胞,单核-巨噬细胞,淋巴细胞,骨髓来源树突状细胞祖细胞,成骨肉瘤细胞,腺癌细胞促进功能 中性粒细胞存活和蛋白合成,移动抑制,氧化代谢,脱颗粒,细胞因子分泌,再循环,IgA介导吞噬作用,ADCC吞噬和杀死病原体,表面受体调变,花生四烯酸释放,白三烯和PAF合成嗜酸性粒细胞存活,细胞毒,白三烯合成嗜碱性粒细胞组胺释放巨噬细胞细胞因子合成,杀灭寄生虫,表面受体、抗原表达,杀灭肿瘤,粘附,氧化代谢朗罕氏细胞成熟,存活力和功能体内 促进造血,嗜酸细胞增多 降低血清胆固醇 髓样细胞增殖综合征 失明和肌肉炎细胞浸润

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